FRET – Mit Fluoreszenz den ungewöhnlichen Funktionen von Cas9 auf der Spur

Leitung: Dina Grohmann

Mitarbeitende: Elisabeth Wörle (Doktorandin), Andreas Schmidbauer (Master-Student), Dr. Leonhard Jakob (PostDoc)

Standort: Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie, Regensburg

Kurzbeschreibung des Projekts:

Das Labor von Dina Grohmann ist darauf spezialisiert, mit Hilfe von fluoreszierenden Farbstoffen, die Funktionsweise einzelner Moleküle zu studieren. Fluoreszenzfarbstoffe können an Biomoleküle gekoppelt werden und die Farbstoffe verhalten sich wie kleine Spione, die dann sehr genau Auskunft über den Zustand des Moleküls geben. Beispielsweise können die Forscher*innen sehr genau den Abstand zwischen zwei Molekül-Positionen bestimmen und damit untersuchen, welches Molekül mit wem wann interagiert. Das ist ganz praktisch, wenn man wissen möchte wie z.B. der Cas9-crRNA-Komplex mit der Ziel-DNA in Kontakt tritt. Die fluoreszenzbasierte Methode nennt sich FRET und steht für Förster-Resonanz-Energie-Transfer (siehe Animation). Da es sich um die Untersuchung von Einzelmolekülen handelt, stellt man noch ein „sm“ für single-molecule vor, also smFRET.

Das Prinzip ist relativ einfach: Man koppelt das eine Molekül, z. B. die Ziel-DNA mit einem Farbstoff, der als „Donor“ dient. Wenn man ihn mit Licht einer bestimmten Wellenlänge (Anregungswellenlänge) bestrahlt, beginnt er zu fluoreszieren – z.B. in einem leuchtenden Grün. Was bedeutet das? Das grüne Leuchten bedeutet, dass der Donor-Farbstoff nun selbst Licht einer bestimmten Wellenlänge abstrahlt (Abstrahlungswellenlänge). Das andere zu untersuchende Molekül, z.B. die crRNA, wurde mit einem Akzeptor-Farbstoff gekoppelt, der nur leuchtet – z.B. in einem strahlend hellen Rot – wenn er sich in unmittelbarer Nähe zum grünen Donor-Farbstoff befindet. Durch die räumliche Nähe von Akzeptor und Donor kann nämlich Energie ausgetauscht werden und die Energie des Donors kann den Akzeptor durch einen Energietransfer zum Strahlen bringen. D.h. sobald das rote Leuchten zu sehen ist, wissen wir, dass sich die beiden Moleküle – die crRNA und die Ziel-DNA – in räumlicher Nähe befinden (Abb. 1). Und zwar sehr nah, in einem Abstand von maximal 10 nm, denn nur dann sind die Moleküle so dicht beieinander, dass die Energie des Donors den Akzeptor überhaupt erreichen und ihn anregen kann. Sind die beiden Moleküle weiter voneinander entfernt, leuchtet nur das Grün alleine (siehe Animation). Diese Methode könnte man sozusagen als Nanometer-Lineal verwenden. 1 nm ist übrigens der millionste Teil eines Millimeters, zum Vergleich: der Durchmesser der DNA beträgt etwa 2 nm, ein Haar ist im Schnitt etwa 60 000 nm dick.

Cas9-FRET
Abb. 1: Wenn die crRNA einen Akzeptor-Farbstoff trägt und der Cas9-crRNA-Komplex an eine Donor-Farbstoff-markierte Ziel-DNA bindet, kann der Donor Energie an den Akzeptor abgeben und der Akzeptor leuchtet aufgrund des FRET-Phänomens [Cas9 in grau, crRNA in weiß, Ziel-DNA in blau/schwarz, Akzeptor-farbstoff: rote Kugel, Donor-Farbstoff: grüne Kugel]. Wenn FRET messbar ist, kann man über dieses Signal nachweisen, dass Cas9 seine Ziel-DNA gefunden und gebunden hat.

Durch ein Mikroskop kann man diese kleinen leuchtenden Moleküle sehen und sie genau charakterisieren (Abb. 2). Das heißt, man kann genau messen, wieviel Energie vom Donor auf den Akzeptor übertragen werden konnte: je näher Donor und Akzeptor beieinander sind, desto effizienter läuft der Energie-Transfer ab und umso mehr leuchtet der Akzeptor in rot. Mit dieser Methodik kann die „Gymnastik“ der Moleküle live, also in Echtzeit, beobachtet werden. Änderungen im FRET-Messwert während der Messung deuten darauf hin, dass der Komplex dynamisch ist – sich also gerade bewegt.

Abb_FRET_Grohmann
Abb. 2: Mithilfe eines äußerst sensitiven Fluoreszenz-Mikroskops kann man die in einer Probenkammer befindlichen und fluoreszierenden Cas9-Moleküle beobachten. Im Mikroskopbild entspricht jeder einzelne farbige Punkt einem einzelnen Cas9-Molekül (grün: Donor-markierte Ziel-DNA alleine, rot: Akzeptor-markierte crRNA in Komplex mit Cas9 ohne DNA, gelbliche Punkte: Cas9-crRNA-DNA Komplex [roter und grüner Farbstoff überlagern sich, FRET messbar].

Mit dieser Einzelmolekül-FRET-Methode möchte die Arbeitsgruppe nun folgende CRISPR-Cas Projekte bearbeiten:

Cas9-Proteine sind bislang dafür bekannt, dass sie mit Hilfe der crRNA-tracrRNA sequenzgenau ein DNA-Molekül aufspüren und spalten – der typische Mechanismus, um die DNA von Viren zu zerstören. Jetzt wurden aber Cas9-Varianten entdeckt, die bestimmte mRNAs ansteuern können und zu deren Abbau führen. So zum Beispiel das Cas9-Protein aus dem Bakterium Francisella novicida, das die mRNA des bakteriellen Lipoproteins (Blp) aufspürt und zu dessen Abbau führt. Dadurch wird die Menge des Blp-Proteins herunterreguliert, und es kann weniger an der Zelloberfläche exprimiert werden. Das ist wiederum kritisch für die Erkennung durch das Immunsystem des befallenen Wirtsorganismus. Hier liegt also die ungewöhnliche Situation vor, dass Cas9 nicht gegen fremde Eindringlinge gerichtet ist, sondern gezielt und sorgfältig austariert, die eigene genetische Information reguliert und beeinflusst, wie infektiös/pathogen das Bakterium für seinen Wirt ist. Interessant ist, dass das FnCas9 (Cas9 aus Francisella novicida) dafür keine crRNA benötigt, dafür aber die tracrRNA (trans-activating crRNA) und eine andere RNA (scaRNA, bzw. non-canonical small RNA). Der genaue Mechanismus ist noch unbekannt. Kürzlich hat sich zudem gezeigt, dass auch die Cas9 Variante aus dem humanpathogenen Bakterium Campylobacter jejuni (dem kleinsten bekannten Cas9-Protein) ebenfalls an mRNAs bindet und einen Komplex bestehend aus crRNA-tracrRNA-mRNA-Cas9 formen kann. Wie unterscheidet sich dieser Komplex in seiner Struktur und seinem dynamischen Verhalten von den üblichen (kanonischen) crRNA-tracrRNA-dsDNA-Cas9-Komplexen? smFRET-Messungen sollen verwendet werden, um diese bisher unbeantwortete Frage zu lösen. Neben Cas9-Varianten werden mit der FRET-Methode auch verwandte Proteine, wie das sogenannte Cas12a-Protein, untersucht. Cas12a bindet ebenfalls crRNAs, benötigt aber keine tracrRNA, um eine Ziel-DNA zu erkennen und zu schneiden. Cas9 und Cas12 unterscheiden sich auf der molekularen Ebene grundlegend. Diese mechanistischen Unterschiede können mit FRET gut untersucht und verstanden werden.

CRISPR team_AG Grohmann
Mitarbeiter in der AG Grohmann, die CRISPR-Cas erforschen (von links nach rechts: Andreas Schmidbauer, Leonhard Jakob, Dina Grohmann, Elisabeth Wörle)

Autorinnen: Heike Ziegler, Dina Grohmann

Bildquelle: Dina Grohmann

Video und Beitragsbild: Redaktion

 

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