Kann es sein, dass die blauen Ausreißer das Plasmid „pCas9“ gar nicht haben? Dann wäre das lacZ-Gen intakt.
Pauline hat die blauen Zellen auf einer Platte mit Ampicillin und Chloramphenicol ausgebracht. Auf dem Plasmid „pCas9“ sitzt eine Resistenz gegen Chloramphenicol, auf dem Plasmid „pSB20HIII“ eine gegen Ampicillin. Die blauen Bakterien wachsen – sie haben also beide Resistenzen.
Um sicher zu gehen, hat Pauline ein „Cracking-Gel“ gemacht. Dazu werden die E. coli-Bakterien einfach aufgebrochen und die DNA wird frei. Auf einem Agarosegel kann man die Plasmide auftrennen und sichtbar machen.
Hier seht ihr einen Ausschnitt aus Pauline´s Laborbuch, und wir können festhalten: beide Plasmide sind in den blauen Ausreißern (#8 bis #12) vorhanden, allerdings kann man nicht sehen, ob die Plasmide sich irgendwie verändert haben (kleinere Deletionen oder Insertionen).
Dieses Gel ist übrigens das Ergebnis eines wiederholten Experiments. Beim ersten Versuch konnte Pauline auf dem „Cracking-Gel“ leider keine Plasmidbanden feststellen, an irgendeiner Stelle des Experiments ist etwas schief gelaufen. Da im normalen Laboralltag eben nicht immer alles sofort beim ersten Anlauf funktioniert, gehört auch ein solches Negativ-Ergebnis mit ins Protokoll:
Wir halten fest: beide Plasmide sind in den blauen Ausreißern vorhanden. Äußerlich und auf dem Gel sehen sie so aus wie die Kontrollen, stammen aber von den geCRISPRten Platten mit den weißen Kolonien…
Und nu? Was könnte Pauline als nächstes tun?