Pauline und die Ausreißer (Teil 2) – Das CRISPR-Experiment kurz erklärt

Einige Bakterien, wie z. B. das Darmbakterium Escherichia coli, können das Protein Lactase (auch β-Galactosidase genannt) herstellen. Dabei handelt es sich um ein Enzym, das den Milchzucker Lactose (ein „Doppelzucker“ oder Disaccharid) für die Bakterien nutzbar macht. Die Lactase bewirkt nun, dass die dem Nährmedium zugegebene farblose Substanz X-Gal zu einem blauen Indigofarbstoff umgesetzt wird, weil das Enzym sowohl X-Gal als auch Lactose spaltet. Das ist ein entscheidender Punkt, denn in Anwesenheit von X-Gal bilden diese Bakterien auf einer Agarplatte blaue Kolonien, die wir somit sehr gut optisch identifizieren können. Das Gen, das für die Lactase codiert und damit für die Blaufärbung verantwortlich ist, heißt lacZ. Schaltet man dieses Gen ab, bilden die Bakterien trotz der Anwesenheit von X-Gal weiße Kolonien. Um genau diesen Effekt herbeizuführen kommt die Genschere CRISPR-Cas9 ins Spiel: mit ihr kann man das lacZ-Gen in den Bakterien punktgenau ansteuern und abschalten. Dazu ist es wichtig zu wissen, dass das CRISPR-Cas9-System zum einen aus dem „Schneideprotein“ Cas9 besteht, und zum anderen aus zwei RNAs: der crRNA, welche dem Cas9-Protein eine sequenzgenaue „Wegbeschreibung“ zu einer bestimmten Stelle innerhalb des lacZ-Gens liefert, und der tracrRNA, welche für die Bindung an Cas9 verantwortlich ist. Diese drei wichtigen Komponenten bringt man in Form eines besonderen Plasmids in die Bakterienzellen ein. Das Plasmid wurde im Labor hergestellt und es trägt sowohl das Gen für Cas9 als auch die Gene für die beiden RNAs (crRNA und tracrRNA). Wenn dieses Plasmid über eine Transformation nun in kompetente E. coli-Zellen eingebracht wird, werden die CRISPR-Cas9-Komponenten hergestellt – also exprimiert – und setzen sich dann in einem Prozess, der „Selbstorganisation“ genannt wird, von alleine zusammen.

Plasmid_Cartoon_vereinfacht
Vereinfachte Darstellung des im Labor hergestellten Plasmids mit den Genen für Cas9, crRNA, tracrRNA und einer Antibiotika-Resistenz (Chloramphenicol; CamR). Nach der Expressionen werden die einzelnen Komponenten von alleine zum CRISPR-Cas9-Komplex zusammengesetzt.

Allerdings nehmen bei der Transformation nur sehr wenige Zellen das Plasmid auf. Damit man erfolgreich transformierte Zellen auch von solchen unterscheiden kann, die keine Plasmid-DNA aufgenommen haben, wird eine Selektion verwendet: das eingebrachte Plasmid trägt nämlich nicht nur die gewünschten Gene, sondern codiert gleichzeitig für eine Antibiotika-Resistenz (Chloramphenicol; CamR). Nur die Bakterienzellen, die das Plasmid aufgenommen haben, können auf einen chloramphenicol-haltigen Nährboden wachsen. Alle anderen Zellen sterben durch das Antibiotikum ab.

Die nachfolgenden Bildreihen veranschaulichen den Unterschied zwischen den Vorgängen in je einer blauen und einer weißen Bakterienzellen in vereinfachter Weise.

Bakterienzelle mit Kontroll-Plasmid
CRISPR-Cas9-System mit unspezifischer crRNA findet keine komplementäre Sequenz innerhalb des lacZ-Gens. lacZ wird normal exprimiert, es kommt zur Blaufärbung.

Bakterienzelle mit CRISPR-Plasmid
CRISPR-Cas9-System mit spezifischer crRNA (lacZ directed) findet die komplementäre Sequenz innerhalb des lacZ-Gens und schneidet die DNA. Das Plasmid wird abgebaut, die Zellen bleiben weiß.

Habt ihr alles verstanden? Wenn nicht, meldet euch 🙂

Pauline macht sich jetzt wieder auf den Weg ins Labor und an die Arbeit, nächste Woche geht´s dann hier weiter!

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