Pauline und die Ausreißer (Teil 3) – Die Suche nach blauen Kolonien

Pauline hat sich zunächst die Aufgabe gestellt, mehr von den Ausreißern zu finden. Wie reproduzierbar sind sie, d.h. gibt es sie in jedem Experiment und wenn ja, wie viele davon? Außerdem braucht sie mehr Untersuchungsmaterial, wenn sie herausfinden will, was bei den Ausreißern „schiefgegangen“ ist. Dazu muss sie das Experiment mindestens noch einmal durchführen – also E. coli-Zellen mit dem Plasmid transformieren, das für die CRISPR-Cas9-Komponenten codiert – und dann möglichst viele Agarplatten ausplattieren. Wir waren live mit der Kamera dabei, und ihr könnt Paulines ersten Versuch hier mitverfolgen:

Wie ihr seht finden sich auf den Platten mit den weißen, geCRISPRten Bakterienzellen in der Tat immer mal wieder vereinzelte blaue Kolonien. Die Kontrolle mit dem Plasmid, das die „falsche“ crRNA enthält, funktioniert einwandfrei: alle Bakterien bleiben wie erwartet blau.

Pauline hat jetzt etliche Ausreißer gefunden. Sie hat sie sorgfältig mit einem sauberen Zahnstocher gepickt, einzeln auf frische Platten übertragen und nummeriert.

Wie geht es jetzt weiter? Was soll Pauline tun, um herauszufinden, warum diese Zellen nicht weiß geworden sind?

Für eure Vorschläge könnt ihr gern die Kommentaroption auf dieser Seite benutzen 🙂

4 Comments

  1. Alle blauen Kolonien anzüchten „minipreps“ machen und an den Stellen, wo die Insertionen erwartet werden sequenzieren.

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    1. Bernd Kriegesmann: hmm, ja. Aber wo erwarten wir Insertionen? Könnten doch auch Deletionen oder Punktmutationen sein? Können wir das etwas einschränken, wo man suchen muss oder sollte? Außerdem sind das ja vermutlich zwei Plasmide (eins mit Cas9 und der crRNA und eins mit lacZ).

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      1. Am wahrscheinlichsten sind doch Mutationen an der Bindungstelle des CRIPR.Cas9 Konstrukts im lacZ Gen. Diese Stelle würde ich sequenzieren.

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