Eine doppelsträngige DNA ist ziemlich stabil. Um die beiden Stränge lokal zu trennen (durch entwinden oder aufschmelzen), ist ein Enzym und Energie notwendig. Enzyme, die doppelsträngige Nukleinsäuren entwinden bezeichnet man als Helikasen. Eine solche Helikaseaktivität ist auch in Cas9 und anderen CRISPR-Cas-Nukleasen enthalten. Wird die Ziel-DNA aufgeschmolzen, so fädelt sich die crRNA ein und bildet Basenpaare mit einem der beiden DNA-Stränge. Der zweite DNA-Strang bleibt einzelsträngig. Weil eine Basenpaarung zwischen DNA und RNA fester ist, bleibt dieser Komplex, den man als R-Loop bezeichnet (Abb. 1), ziemlich stabil. Erst wenn der Schnitt erfolgt ist, zerfällt er wieder.
