PAM

PAM (protospacer adjacent motif) ist eine kurze Sequenz von 2-6 Nukleotiden, die neben der Zielsequenz der crRNA liegt. Die PAM-Sequenz ist nicht Teil der crRNA!

Sie gibt dem Komplex aus Schneideenzym (Nuklease, z.B. Cas9) und crRNA eine Vorauswahl, um seine Zielsequenz zu finden. Damit der Komplex mit hoher Geschwindigkeit über die DNA laufen kann, wird nicht an jeder Stelle ein Abgleich mit der crRNA gemacht. Nur wenn er über eine PAM-Sequenz läuft hält er kurz an und die crRNA versucht mit der danebenliegenden Sequenz eine Basenpaarung. Wenn die Sequenz passt, „rastet“ das Enzym ein und der Schneidevorgang findet statt. Passt die Sequenz nicht, läuft der Komplex weiter und stoppt erst wieder am nächsten PAM.

In der Anwendung bedeutet das, dass man zwar jede beliebige crRNA synthetisch herstellen kann, aber nicht jede Sequenz ist als Ziel geeignet: es muss immer ein PAM daneben liegen.

Wenn Bakterien sich einen neuen Spacer aus einem angreifenden Virus holen, dann ist das auch keine zufällige Sequenz irgendwo im Virusgenom. Es werden nur Stücke ausgeschnitten, die neben einem PAM liegen. Das Ausschneiden erfolgt durch die Proteine Cas1 und Cas2, die in der viralen DNA die PAM-Sequenz erkennen. Ebenso erkennt das Schneideenzym die PAM-Sequenz. Die Erkennung erfolgt nicht über Basenpaarung, sondern über ein paar Aminosäuren in dem Protein, die eine bestimmte Basensequenz erkennen und binden können.