nCas9 und dCas9

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Das Cas9-Protein besteht aus mehreren Domänen, also Abschnitten in der Aminosäure-Kette, die einzelne Funktionen ausführen. So ist ein Abschnitt z.B. für die Erkennung und Bindung der crRNA verantwortlich, ein anderer für die Erkennung und Bindung der DNA, wieder ein anderer für die Erkennung der PAM-Sequenz. Diese Abschnitte werden als Domänen bezeichnet.

RuvC und HNH sind die zwei Domänen in Cas9, die unabhängig voneinander die beiden Stränge der Ziel-DNA schneiden, sie werden daher als Nuklease-Domänen bezeichnet. Man kennt den Mechanismus der Schneideaktivität sehr gut und kann deshalb sagen, dass in der RuvC-Domäne die Aminosäure D10 (Asparaginsäure in Position 10) essentiell für das Schneiden ist. Tauscht man sie gegen die Aminosäure Alanin aus, kann RuvC nicht mehr schneiden. Der Austausch wird als D10A bezeichnet. Die Funktion aller anderen Domänen bleibt erhalten. Das modifizierte Cas9-Protein kann deshalb nach wie vor eine Zielsequenz erkennen, dort aber nur einen der beiden DNA-Stränge schneiden, also „einen Nick“ setzen. Man bezeichnet diese Mutante deshalb als „nCas9“ oder „Nickase“. Die Nickase wird für verschiedene Anwendungen eingesetzt, z.B. beim „Base-Editing“ oder „Prime-Editing“ und wird verwendet, um versetzte DNA-Schnitte zu erzeugen, die eine präzisere Editierung erlauben.

Ähnlich wie bei der RuvC-Domäne, kann in der HNH-Domäne die Aminosäure H810 (Histidin in Position 810) gegen ein Alanin ausgetauscht werden (H810A), um die Schneideaktivität von HNH zu zerstören. Damit wäre eine andere Nickase erzeugt.

Werden beide Nuklease-Domänen (RuvC und HNH) mutiert, so entsteht ein Cas9-Protein, das keine Schneideaktivität mehr hat und als „dCas9“ oder „dead Cas9“ bezeichnet wird. Weil alle anderen Funktionen erhalten bleiben, kann dCas9 nach wie vor an spezifische Stellen der DNA geleitet werden. Durch die bloße Bindung an die DNA kann für andere Proteine (z.B. Aktivatoren der Genexpression) der Zugang blockiert werden.

Eine ebenfalls interessante Anwendung ist die Kopplung anderer Proteine an dCas9. So können an bestimmten Stellen der DNA z.B. epigenetische Veränderungen vorgenommen werden, indem man das dafür notwendige Enzym an dCas9 fusioniert.

Ein weiteres Anwendungsbeispiel für die Grundlagenforschung ist die optische Markierung bestimmter DNA-Sequenzen im Genom. Dazu wird das Grün Fluoreszierende Protein (GFP) an dCas9 gekoppelt, wodurch die so markierte Sequenz im Mikroskop als grüner Punkt sichtbar wird.

Auszug aus dem CRISPR-Cas-Familienalbum
nCas9 und dCas9 aus dem CRISPR-Familienalbum von Lukas Kummer