PAM

PAM (Protospacer Adjacent Motif) ist eine kurze Sequenz von meist 2-6 Nukleotiden (siehe unten), die auf der Ziel-DNA neben der Zielsequenz der crRNA liegt. Die PAM-Sequenz ist nicht Teil der crRNA!

Sie gibt dem Komplex aus Schneideenzym (Nuklease, z.B. Cas9) und crRNA eine Vorauswahl, um seine Zielsequenz zu finden. Damit der Komplex mit hoher Geschwindigkeit über die DNA laufen kann, wird nicht an jeder Stelle ein Abgleich mit der crRNA gemacht. Nur wenn er über eine PAM-Sequenz läuft hält der Komplex kurz an und die crRNA versucht mit der danebenliegenden Sequenz eine Basenpaarung. Wenn die Sequenz passt, „rastet“ das Enzym ein und der Schneidevorgang findet statt. Passt die Sequenz nicht, läuft der Komplex weiter und stoppt erst wieder am nächsten PAM.

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In der Anwendung bedeutet das, dass man zwar jede beliebige crRNA synthetisch herstellen kann, aber nicht jede Sequenz ist als Ziel geeignet: es muss immer ein PAM daneben liegen.

Wenn Bakterien sich einen neuen Spacer aus einem angreifenden Virus holen, dann ist das auch keine ganz zufällige Sequenz irgendwo im Virusgenom. Es werden nur Stücke ausgeschnitten, die neben einem PAM liegen. Die ausgeschnittenen Stücke heißen Protospacer und stellen die zukünftigen Zielsequenzen auf dem Virusgenom dar. Das Ausschneiden erfolgt durch die Proteine Cas1 und Cas2, die in der viralen DNA die PAM-Sequenz erkennen. Ebenso erkennt das Schneideenzym (Nuklease, z.B. Cas9) die PAM-Sequenz. Dabei erfolgt die Erkennung nicht über Basenpaarung, sondern über ein paar Aminosäuren im Cas-Protein, die eine bestimmte Basensequenz erkennen und binden können.

Die Cas9-Proteine aus unterschiedlichen Organismen erkennen unterschiedliche PAM-Sequenzen.

CRISPR Nuklease	Ursprungsorganismus	PAM Sequenz (5 – 3′)
SpCas9	Streptococcus pyogenes	NGG
SaCas9	Staphylococcus aureus	NGRRT
NmeCas9	Neisseria meningitidis	NNNNGATT
CjCas9	Campylobacter jejuni	NNNNRYAC
StCas9	Streptococcus thermophilus	NNAGAA

N = A, T, G oder C; Y = C oder T; R = G oder A