Pauline und die Ausreißer (Teil 8) – Des Rätsels Lösung!

Weiter geht’s mit dem Sequenzieren. Nach dem nun klar war, dass die Zielsequenz auf dem lacZ-Gen nicht mutiert ist, hat sich Pauline der crRNA-Sequenz gewidmet. Zunächst hat sie dafür wieder Bakterien-DNA aus den blauen Ausreißern isoliert und dann den Bereich über der crRNA sequenziert.  Genauer gesagt den Bereich, der auf dem Plasmid für die crRNA codiert (oberer Teil von Abb. 1). Und was kam dabei raus? Das zeigt euch das Alignment im unteren Teil der ersten Abbildung. Oha!!

Abbildung 1 (A-B)
Abb. 1-A (oben): Schematische Darstellung des Plasmids, das für die crRNA, Cas9 und die tracrRNA codiert. In der Vergrößerung ist die Sequenz, die für die crRNA codiert, fett hervorgehoben und die einzelnen Abschnitte darunter mit grünen Balken illustriert. 1-B (unten): Sequenzvergleich von sechs Ausreißern (E 1-6) gegenüber der normalen crRNA-Sequenz (Referenz). Rot = Übereinstimmung; blau = mindestens eine Sequenzposition ist anders; (-) schwarzer Strich = Base fehlt

Vier von den sechs Ausreißern (E 1, E 2, E 3 und E 5) weisen eine Deletion – also den Verlust von Basenpaaren – auf! Und nicht nur das, die Deletion ist bei allen vieren genau gleich! Sie umfasst 64 Basenpaare! Das musste sich Pauline genauer anschauen (Abb. 2).

Pauline bei der Begutachtung des Alignments
Abb. 2: Pauline bei der Analyse des Sequenz-Alignments am Laptop

Die Auswertung ergab, dass immer der lacZ-spezifische Spacer und einer der beiden Repeats fehlen – der Bereich wurde exakt herausgeschnitten. Somit ist es kein Wunder, dass diese betreffenden Zellen blau sind, da ihnen die crRNA fehlt, findet in ihnen überhaupt kein CRISPRn mehr statt! Welche der beiden Repeat-Sequenzen (die rechte oder die linke) zusammen mit dem Spacer herausgeschnitten wurde, kann Pauline nicht sagen.

Abb 3
Abb. 3: Deletion des lacZ-spezifischen Spacers und einer Repeat-Sequenz in den Ausreißern. Die beiden möglichen Deletionsereignisse sind mit Hilfe der beiden grünen Dreiecke angegeben

Warum ist dieser Abschnitt in den vier unabhängigen Ausreißern genau gleich ausgeschnitten? Mutationen sind doch zufällige Ereignisse? Das stimmt natürlich! Durch die Repeats kann es aber leicht zu Rekombinationen kommen und die führen meistens zu demselben Deletionsergebnis – wie wir hier sehen (Abb. 3). Pauline ist der Lösung des Rätsels also ein gutes Stück näher gekommen.

Aber was ist mit den restlichen Ausreißern, die keine Deletion in der crRNA aufweisen und dennoch blau sind? Bleibt noch die tracrRNA und das Protein Cas9 selbst. Die tracrRNA hat Pauline inzwischen ebenfalls sequenziert. Die war bei allen restlichen Ausreißern in Ordnung. Da die tracrRNA und Cas9 sehr dicht beieinander liegen, konnte Pauline auch schon ein wenig in das Cas9-Gen hineinsequenzieren. Bei einem Ausreißer hat sie eine Punktmutation gefunden (an der Position 14: A>G), sodass das Protein an Position 5 ein Cystein anstelle eines Tyrosins aufweist (Y5C). Ob diese Mutation wirklich die Funktion von Cas9 zerstört, müsste Pauline nun überprüfen: sie müsste genau diese Sequenz, bzw. das Plasmid mit dieser Sequenz, in andere Bakterien einbringen und schauen, ob diese dann ebenfalls nicht geCRISPRt werden. Sie müsste auch das Cas9-Gen in allen anderen Ausreißern durchsequenzieren, nach Mutationen suchen, die die Aminosäuresequenz verändern und prüfen, ob das Cas9-Protein noch funktionsfähig ist. Das ist alles sehr aufwändig und schon wieder ein neues Projekt…

Pauline_GIF

Damit haben wir vorerst das Ende unseres kleinen CRISPR-Mitmachprojekts erreicht und bedanken uns bei allen, die ihre Ideen zur Lösung des Rätsels hier mit Pauline geteilt haben!! 🙂

The End

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