Pauline und die Ausreißer (Teil 7) – Die Zielsequenz sequenzieren

Liegt das Geheimnis der CRISPR-Escaper in einer (winzigen) Abweichung ihres genetischen Codes versteckt? Haben die blauen Ausreißer womöglich eine stumme Mutation in der CRISPR-Cas-Zielsequenz auf dem lacZ-Gen, so dass sie nicht mehr richtig erkannt wird?

Pauline will diesen Bereich auf dem lacZ-Gen sequenzieren, d.h. die exakte Basenabfolge der DNA „lesen“. Bernd Kriegesmann hatte das in den Kommentaren ebenfalls vorgeschlagen. Pauline muss dafür zunächst die DNA aus dem Bakterien isolieren, je sauberer die DNA, desto besser verläuft die Sequenzierung. Dann benötigt sie noch einen Primer, das ist ein kurzes Stück DNA, das die Startstelle für die Sequenzierung festlegt – damit man auch an der Stelle „liest“ wo es spannend ist. Und dann? Pauline zeigt es euch in ihrem Video:

Ja, so schnell und einfach geht das inzwischen. Kaum jemand sequenziert heute noch selbst, man schickt lediglich die entsprechenden Proben auf dem Postweg an ein Sequezierlabor. Dieses führt dann in einem automatisierten Prozess die eigentliche Sequenzierreaktion durch und generiert die jeweilige DNA-Sequenz. Nach wenigen Tagen erhält man eine E-Mail mit der Basenabfolge, zum einen als reine Text-Datei (eine sogenannte FASTA-Datei) und zum anderen auch ein Chromatogramm (so eines wie in den nachfolgenden Abbildungen), anhand dessen man die Qualität der Sequenzierung überprüft und eine Sequenzanalyse vornimmt. Ein „Read“, das ist die Sequenz, die an einem Stück gelesen werden kann – in unserem Fall eine Sequenz von etwa 1000 bp – kostet übrigens rund 3,50 €. Wie die Sequenzierung genau abläuft ist für sich genommen schon wieder einen eigenen Beitrag wert und sprengt hier den Rahmen unserer Geschichte. Für Interessiert gibt es eine kurze und einfache Erklärung vom Max-Planck-Institut für Pflanzenphysiologie Potsdam: Klassische DNA-Sequenzierung nach Sanger.

Pauline hatte mit ihrer ersten Sequenzierung kein Glück. Die Reads waren „Kraut und Rüben“ und überhaupt nicht lesbar. Das sah z.B. so aus:

Schlechte Sequenz
Ausschnitt aus dem Chromatogramm einer nicht lesbaren Sequenz. Die optischen Signale („peaks“), die in vier Farben dargestellt werden und den vier Nukleotiden A, T, G und C entsprechen, überlagern sich und machen eine klare Zuordnung an den einzelnen Positionen unmöglich.

Nachdem auch im zweiten Anlauf nach wiederholter DNA-Aufreinigung und Einsenden der Proben keine lesbaren Reads erzielt werden konnten, haben Pauline und ihre wissenschaftliche Betreuerin die Köpfe im Online-Chat zusammengesteckt und am Ende beschlossen, erstmal einen neuen Primer zu bestellen. Neuer Primer, neues Glück! Und tatsächlich sahen die meisten Sequenzen nun gut aus:

lacZ nice Sequence chromatogram
Ausschnitt aus dem Chromatogramm einer sehr gut lesbaren Sequenz. Hier ermöglichen die optischen Signale („peaks“) eine eindeutige Bestimmung der Basenabfolge.

Nun konnte Pauline endlich mit der Sequenzanalyse beginnen. Und das sind ihre Ergebnisse:

Alle auswertbaren Sequenzen (fünf von acht) zeigten die normale, unveränderte lacZ-Sequenz. Im Folgenden ist das „Alignment“, der Sequenzabgleich, von drei Ausreißern (T1E1, T1E2, T2E3) dargestellt. Die DNA-Sequenzen der Ausreißer werden mit der lacZ-Sequenz (ganz oben) als Referenz verglichen. Bei einem Alignment wird zusätzlich noch eine „Consensus“-Sequenz erstellt (ganz unten), sie entspricht der Basenabfolge mit der größten Übereinstimmung aller verglichenen Sequenzen.

Alignment
Alignment der drei Ausreißer T1E1, T1E2 und T2E3 gegen die lacZ-Referenz (ganz oben) und die erhaltene Consensus-Sequenz (ganz unten).

Stimmen die Sequenzen überein, steht also bei allen Sequenzen an der gleichen Stelle die gleiche Base, sind die Basen rot, sobald eine Sequenz anders ist, wird diese Stelle in schwarz dargestellt und die verbleibenden gleichen Basen in blau. Auf den ersten Blick ist zu erkennen, dass die Sequenzen über den allergrößten Bereich übereinstimmen. Mit einem grünen Pfeil hat Pauline auch die Position des Primers eingezeichnet, also die Stelle von wo aus gelesen wurde. Man sieht, dass das Lesen am Anfang noch ein weinig „holprig“ ist, diese Abweichungen haben nichts zu bedeuten – genauso am Ende der Sequenzen, auch hier werden die Sequenzierungen immer ungenauer und gehen nicht in die Bewertung ein.

Doch wie sieht es nun mit der CRISPR-Cas-Zielsequenz auf dem lacZ-Gen aus? Auch die hat Pauline eingezeichnet (schwarzer Kasten). Keine Mutation! Die Sequenzen der Ausreißer entsprechen der Referenz. Eine Mutation in der Zielsequenz ist – zumindest bei denen, die Pauline sequenzieren konnte – nicht verantwortlich dafür, dass die Genschere CRISPR-Cas bei den Ausreißern nicht funktioniert.

Wie geht es nun weiter? Soll Pauline weitere Ausreißer hinsichtlich der lacZ-Sequenz analysieren? Oder soll sie lieber andere Komponenten des CRISPR-Cas-Systems unter die Lupe nehmen?

Pauline freut sich über eure Vorschläge, die ihr unten im Kommentarfeld aufschreiben könnt!

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