Pauline und die Ausreißer (Teil 3) – Die Suche nach blauen Kolonien

Pauline hat sich zunächst die Aufgabe gestellt, mehr von den Ausreißern zu finden. Wie reproduzierbar sind sie, d.h. gibt es sie in jedem Experiment und wenn ja, wie viele davon? Außerdem braucht sie mehr Untersuchungsmaterial, wenn sie herausfinden will, was bei den Ausreißern „schiefgegangen“ ist. Dazu muss sie das Experiment mindestens noch einmal durchführen – also E. coli-Zellen mit dem Plasmid transformieren, das für die CRISPR-Cas9-Komponenten codiert – und dann möglichst viele Agarplatten ausplattieren. Wir waren live mit der Kamera dabei, und ihr könnt Paulines ersten Versuch hier mitverfolgen:

Wie ihr seht finden sich auf den Platten mit den weißen, geCRISPRten Bakterienzellen in der Tat immer mal wieder vereinzelte blaue Kolonien. Die Kontrolle mit dem Plasmid, das die „falsche“ crRNA enthält, funktioniert einwandfrei: alle Bakterien bleiben wie erwartet blau.

Pauline hat jetzt etliche Ausreißer gefunden. Sie hat sie sorgfältig mit einem sauberen Zahnstocher gepickt, einzeln auf frische Platten übertragen und nummeriert.

Wie geht es jetzt weiter? Was soll Pauline tun, um herauszufinden, warum diese Zellen nicht weiß geworden sind?

Für eure Vorschläge könnt ihr gern die Kommentaroption auf dieser Seite benutzen 🙂


Beitrag veröffentlicht

in

von

Kommentare

4 Antworten zu „Pauline und die Ausreißer (Teil 3) – Die Suche nach blauen Kolonien“

  1. Avatar von Bernd Kriegesmann
    Bernd Kriegesmann

    Alle blauen Kolonien anzüchten „minipreps“ machen und an den Stellen, wo die Insertionen erwartet werden sequenzieren.

    1. Avatar von Wolfgang Nellen
      Wolfgang Nellen

      Bernd Kriegesmann: hmm, ja. Aber wo erwarten wir Insertionen? Könnten doch auch Deletionen oder Punktmutationen sein? Können wir das etwas einschränken, wo man suchen muss oder sollte? Außerdem sind das ja vermutlich zwei Plasmide (eins mit Cas9 und der crRNA und eins mit lacZ).

      1. Avatar von Bernd Kriegesmann
        Bernd Kriegesmann

        Am wahrscheinlichsten sind doch Mutationen an der Bindungstelle des CRIPR.Cas9 Konstrukts im lacZ Gen. Diese Stelle würde ich sequenzieren.

      2. Avatar von Wolfgang Nellen
        Wolfgang Nellen

        Bernd Kriegesmann: ja, gute Idee! Wird Pauline machen!