Cas-Proteine ohne CRISPR-Arrays und CRISPR-Arrays ohne Cas-Proteine erscheinen so nutzlos, wie Beamte ohne Formulare oder Formulare ohne Beamte. Im Gegensatz zu manchen Behörden, würden in einem biologischen Organismus Beamte (= Proteine) ohne Funktion aber sehr schnell gekündigt, das heißt: Die Gene würden mutieren und meist verloren gehen. Wenn sie dennoch erhalten bleiben, dann nimmt man an, dass sie einen anderen Job übernommen haben.
Wie kriegt man raus, was die jetzt machen? Biochemiker und Molekularbiologen haben eine Reihe verschiedener Ansätze entwickelt, um das zu untersuchen.
- Eine relativ einfache Methode ist es, die Waisenkinder gentechnisch aus dem Genom zu entfernen. Das ist meist nicht so schwer. Dann kann man schauen, ob der Organismus noch lebensfähig ist oder vielleicht etwas schwächlich oder in bestimmten Lebenssituationen nicht mehr so gut zurechtkommt. Der Verlust eines Waisen-Cas bedeutet nicht unbedingt, dass ein Bakterium gar nicht mehr leben kann! Meistens sind es nur ganz bestimmte Bedingungen, unter denen sich der Verlust negativ bemerkbar macht. Man sucht also nach der Nadel im Heuhaufen: Wachsen sie langsamer, wenn es zu warm oder zu kalt wird? Wenn zu wenig oder zu viel Salz im Futter ist? Wenn sie zu viel oder zu wenig Licht haben? Oder wenn sie von Viren angegriffen werden? Man kann unendlich viele Bedingungen austesten, es gibt aber eine Reihe von Standards, die mehr oder weniger in allen Laboren getestet werden, es steht aber jedem Wissenschaftler frei, zusätzliche Ideen auszuprobieren. Hat man schließlich einen Effekt gefunden, dann beginnt erst die eigentliche Arbeit, nämlich die molekularbiologische Analyse, wie das verwaiste Cas-Protein oder die crRNA diesen Effekt bewirkt.
- Viele der Cas-Proteine sind inzwischen sehr gut untersucht und man kennt sehr detailliert ihre Struktur und Funktion. Dazu werden komplizierte Methoden wie z. B. Röntgenstrukturanalyse oder Cryo-Elektronenmikroskopie angewandt. Die Daten werden in großen Datenbanken hinterlegt und man kann daraus sehr genaue 3D-Modelle bauen.
3D-Modell eines Cas9-Proteins Diese Daten helfen auch dabei, bisher unbekannte Cas-Proteine durch Vergleiche zu modellieren. Damit kann man recht zuverlässige Vorhersagen treffen, ob bestimmte Funktionen (z. B. das Schneiden von DNA oder die Bindung von crRNA) verloren gegangen sind oder ob andere Funktionen hinzugekommen sind.
- Wenn man Vermutungen hat, welche Funktionen ein Orphan-Cas hat, dann kann man das im Reagenzglas überprüfen. Es ist kein großes Problem, eine große Menge dieser Cas-Proteine herzustellen. Im Experiment kann man ihnen dann eine Aufgabe stellen, z. B. eine bestimmte RNA zu binden, RNA oder DNA zu zerschneiden usw. Dazu sind meist viele Versuche erforderlich, weil man ja nicht die genauen Reaktionsbedingungen kennt und auch für die Funktion nur eine Vermutung hat. Es kann lange dauern, bis man die richtigen Bedingungen gefunden hat und ein Protein endlich das tut, was man vermutet.
Man mag sich fragen, ob dieser Aufwand gerechtfertigt ist, um ein Protein aus einem Mikroorganismus etwas besser zu verstehen. Aber auch bei der ursprünglichen Untersuchung des CRISPR-Cas-Systems war überhaupt nicht absehbar, welche umfassenden Anwendungsmöglichkeiten daraus entstehen konnten (siehe auch unseren Beitrag zum Sinn und Zweck von Grundlagenforschung)!
Über die CRISPR-Cas Mysterien erzählt auch unser neuer Comic: CRISPR-Cas Mysterien – Teil 2